本发明属于棉籽肽技术领域，具体涉及基于多酶协同定向酶解制备的棉籽肽及其制备方法和应用。所述基于多酶协同定向酶解制备棉籽肽的制备方法包括以下步骤：（1）将棉籽粉碎，得到棉籽粉；（2）将棉籽粉和水混合均匀，得到混合料，向混合料中加入复合菌，进行发酵，发酵结束后灭菌，得到发酵产物；（3）向发酵产物中继续加入碱性蛋白酶，进行酶解反应，反应结束后灭酶，继续加入菠萝蛋白酶进行酶解反应，反应结束后灭酶，得到酶解产物；（4）将酶解产物进行离心，收集上清液，干燥，得到棉籽肽。本发明制备的棉籽肽可以用于制备幼仔猪饲料，提高肠胃健康。